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Tumor Suppressor Protein p53

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Background: Recently a distinct p53 immunohistochemistry (IHC) profile was described in colorectal cancer (CRC), different from the strongly positive or the negative ones. This new restricted p53 overexpression pattern (p53IHC RO) was previously associated with microsatellite instability (MSI), it displayed specific clinico-pathological features and tended to be a marker for better outcome. Aim: Our aim is to confirm this association and to characterize p53IHC RO. Like MSI status as a prognostic marker, we will also focus on stage II patients to observe whether p53IHC RO can help in decision making for treatment. Materials and methods: Population is a cohort of patients operated for CRC at the Cliniques Universitaires Saint-Luc between 1998 and 2014 for whom we have the immunostaining of MMR proteins (ML1l, MSH2, MSH6 and PMS2) and p53 performed at peri-operative time. The p53 IHC results were considered either as negative, strongly positive or restricted overexpression. For surexpression groups of p53, comparisons of clinico-pathological data and numerical data were respectively obtained by Mann-Whitney and Fisher exact test. Overall survival and disease-free survival were estimated by Kaplan-Meier estimator, and log-rank test was performed to compare the curves. Results are considered statistically significative for a p-value <0.05.Results: There is a significant association between p53IHC RO and MSI-H (33.3%, p<0.001) in CRC. We also describe MSI-independent clinico-pathological features for this pattern : female sex (54.3%, p=0.018), colon cancer (70.3%, p=0.003), mucoid histology (11.6%, p=0.002), early stages (54 .6%, p=0.48) and lower lymph node ratio (0.074, p=0.069). We found no better outcome for patients with p53IHC RO tumors in ail patients together. Only patients with stage II tumors with high risk of recurrence (T4 tumor, lymphovascular and peri-nervous permeation, obstruction, perforation, <12 lymph nodes sampled) had a worse outcome associated with p53IHC RO (p=0.033).Conclusion: p53 IHC RO tumors are closely related to MSI status in CRC and they show particular clinico-pathological features. Prognostic value is not evident, but it appears to be a marker for bad prognosis in CRC stage II patients with high risk features. Contexte : Un profil immunohistochimique (IHC) de p53 distinct a récemment été décrit dans le cancer colorectal (CCR), différent des profils soit négatif soit positif. Une étude précédente montrait que ce profil de surexpression restreinte (p53IHC RO) serait associé au statut d'instabilité des microsatellites (MSI), présenterait des caractéristiques clinico-pathologiques particulières, et pourrait être marqueur de meilleur pronostic. But : Notre objectif est de confirmer cette association et de caractériser le profil p53IHC RO. Par analogie au rôle pronostique du statut MSI, nous étudierons également les patients stade II à part pour déceler un éventuel impact de p53IHC RO sur la prise en charge du patient. Matériel et méthodes : On utilise l'expression IHC tumorale de p53 et MMR (MLHl, MSH2, MSH6 et PMS2) et les données médicales pour une cohorte de patients opérés d'un CCR aux Cliniques Universitaires Saint-Luc entre 1998 et 2014. Les résultats IHC de p53 ont été considérés comme négatif, intense ou de surexpression restreinte. Entre les groupe de surexpression de p53, les comparaisons des données clinico-pathologiques et numériques ont été respectivement évaluées par les tests de Mann-Whitney et Fisher exact. Les survies globale et sans maladie ont été estimées par la méthode de Kaplan-Meier, avec une comparaison des courbes par test log-rank. Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs pour une p-value <0.05.Résultats : Il y a une association significative entre p53IHC RO et le statut MSI-H (33.3%, p<0.001) dans le CCR. Nous associons aussi à ce profil ces caractéristiques, indépendamment du statut MSI : majorité féminine (54.3%, p=0.018), cancers coliques nettement majoritaires (70.3%, p=0.003), composante mucoïde (11.6%, p=0.002), une majorité de stades précoces (54.6%, p=0.048) et aussi un ratio ganglionnaire plus bas (0.074, p=0.069). Nous n'avons pas retrouvé d'impact pronostique positif de p53IHC RO pour l'ensemble de la cohorte analysée. Seul le sous-groupe des patients avec une tumeur de stade II à haut risque de rechute (tumeur T4, perméations lymphovasculaires et périnerveuses, occlusion, perforation, nombres de ganglions retrouvés inférieur à 12) présentait un pronostic plus défavorable associé au statut p53 restreint (p =0.033).Conclusion : Les tumeurs p53IHC RO sont associées au statut MSI-H et ont profil clinico­ pathologique propre. Ce profil IHC n'a pas un rôle pronostique clair, il semble cependant être associé à une moins bonne survie chez les patients avec une tumeur de stade II à haut risque.

FullTumor Suppressor Protein p53 --- Colorectal Neoplasms --- Immunohistochemistry

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Ovarian Neoplasms --- Receptor, Epidermal Growth Factor --- Tumor Suppressor Protein p53 --- enzymology --- metabolism --- biosynthesis

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Vulvar Diseases --- Vulvar Neoplasms --- Tumor Suppressor Protein p53 --- pathology --- chemistry --- analysis

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Deoxycytidine kinase (dCK) catalyzes the phosphorylation of deoxycytidine, deoxyadenosine and deoxyguanosine, using ATP or UTP as phosphate donor. This is the rate-limiting reaction in the salvage of deoxyribonucleosides, which supplies cells with dNTPs for DNA synthesis. In addition, dCK phosphorylates and activates a number of nucleoside analogues used in anticancer and antiviral chemotherapy. Studies of the mechanisms that control the activity of the enzyme are thus of particular interest. Recently, it has been demonstrated in our lab that dCK is a phosphoenzyme containing at least four phosphorylation sites. Moreover, phosphorylation of Ser-74 was found to be essential for the control of dCK activity. However, the signalling pathway leading to the phosphorylation and the activation of dCK is not known yet.
The first objective of my study was to analyze in EHEB cells whether GSK-3 was implicated in the regulation of dCK. Indeed, TDZD-8, a specific inhibitor of GSK-3, was able to suppress the activation of dCK induced by the nucleoside analogue 2-chloro-2’-deoxyadenosine (CdA). First, we have shown that TDZD-8 also reduced the activation of dCK induced by several other genotoxic agents, such as genistein and aphidicolin. However, other inhibitors of GSK-3, such as Li+ and alsterpaullone, were unable to reduce dCK activation by CdA or others agents, despite the fact that they were found to inhibit GSK-3 in vitro as well as in intact cells. These results disagreed with a role of GSK-3 in the regulation of dCK activity. This conclusion was strengthened by our observation that CdA, which activates dCK, did not modify GSK-3 activity. Moreover, GSK-3 was not able to phosphorylate recombinant dCK in vitro. Concerning the TDZD-8, we have shown that its effect in intact cells could neither be explained by a direct effect on dCK activity nor by inhibition of CdA metabolism. Thus, we suggest that TDZD-8 reduces dCK activation not via inhibition of GSK-3, but via inhibition of another protein kinase that remains to identify.
The second step of our study was to examine whether the transcription factor p53 was involved in the regulation of dCK activity. Indeed, it had been reported that pifithrin-, a pharmacological inhibitor of p53, abolished the activation of dCK by CdA. The hypothesis of a role of p53 in the control of dCK activity was attractive because the majority of the agents that activate dCK are genotoxic and induce p53 activation. However, the effect of pifithrin- reported in the literature was not reproduced in our lab. Moreover, we showed that elevation of p53 was not always followed by an activation of dCK. Finally, we noted that inhibition of protein kinases responsible for the phosphorylation and the activation of p53 did not affect dCK activation by CdA. Taken together, these results indicate that the p53 pathway is not involved in the control of dCK activity. La désoxycytidine kinase (dCK) catalyse la phosphorylation de la désoxycytidine, de la désoxyadénosine et de la désoxyguanosine, l'étape limitante de la voie de récupération des désoxynucléosides qui mène à la formation des dNTPs, précurseurs de l'ADN. En plus de ce rôle physiologique, la dCK phosphoryle et active un grand nombre d'analogues de nucléosides utilisés en chimiothérapie anticancéreuse et antivirale, d'où l'intérêt porté à cette enzyme. Il a été récemment démontré au laboratoire que l'activité de la dCK était régulée par phosphorylation, en particulier de la Ser-74. La voie de signalisation qui mène à la phosphorylation et l'activation de la dCK n'est cependant pas encore élucidée.
Le premier objectif de mon travail était d'analyser si la GSK-3 était impliquée dans la régulation de l'activité de la dCK. En effet, un inhibiteur spécifique de cette protéine kinase, le TDZD-8, était capable de supprimer l'activation de cette enzyme provoquée par l'analogue de nucléoside 2-chloro-2'-désoxyadénosine (CdA). Nous avons commencé par montrer que le TDZD-8 supprimait aussi l'activation de la dCK induite par d'autres agents génotoxiques, comme la génistéine et l'aphidicoline. Malheureusement, ces effets ne purent être reproduits par d'autres inhibiteurs de la GSK-3 (Li+, alsterpaullone, SB-216763), qui pourtant semblaient efficaces aussi bien in vitro que dans la cellule intacte. Ces résultats mettaient en doute un rôle de la GSK-3 dans la régulation de la dCK. D'autre part, la GSK-3 n'est pas capable de phosphoryler directement la dCK recombinante in vitro. De plus, la CdA qui active la dCK ne modifie pas l'activité de la GSK-3, ainsi que nous l'avons constaté après avoir mis au point le dosage de cette protéine kinase. Nous en concluons qu’il est peu probable que la GSK-3 joue un rôle dans la régulation de l'activité de la dCK. Quant à l'effet du TDZD-8, nous avons montré qu'il ne peut s'expliquer ni par un effet direct sur l'activité de la dCK, ni par une inhibition du métabolisme de la CdA. Nous suggérons qu'il inhibe une autre protéine kinase que la GSK-3, qui serait elle réellement impliquée dans le contrôle de l'activité de la dCK.
Le second objectif de mon travail était d'examiner si le facteur de transcription p53 jouait un rôle dans la régulation de l'activité de la dCK. La littérature rapportait en effet que l'activation de la dCK par la CdA était supprimée par la pifithrin-, un inhibiteur de l'activité transcriptionnelle de p53. Cette hypothèse était plausible puisque la plupart des agents qui activent la dCK sont génotoxiques et activent p53. D'une part, l'effet de la pifithrin- décrit dans la littérature n'a pu être reproduit au laboratoire. D'autre part, nous avons montré que l'activation de p53 n'était pas toujours suivie d'une activation de la dCK. Finalement, l'inhibition des protéines kinases responsables de la phosphorylation et de l'activation de p53 n'affecte pas l'activation de la dCK. Ces résultats suggèrent que la voie p53 n'est pas impliquée dans le contrôle de l'activité de la dCK.

glycogen synthase kinase 3 beta --- Tumor Suppressor Protein p53 --- Deoxycytidine Kinase --- Dideoxyribonucleases --- Humans --- Tumor Cells, Cultured --- Leukemia, Lymphoid